А. В. Усатов, к.х.н, директор НОЦ АВТЕХ
Опубликовано: "Фармацевтические технологии и упаковка" №4.2, 2021
Сложная эпидемиологическая обстановка в мире в последние годы, включая регулярные вспышки вирусных заболеваний, как, например, эпидемия атипичной пневмонии в 2003 году (коронавирус SARS-CoV-1), эпидемия «свиного» гриппа А (H1N1) в 2009 году, распространение острого респираторного синдрома (MERS-CoV) в 2012-м, вспышки лихорадки Эбола в 2014, 2016 и 2018 годах и развивающаяся с 2019 г. пандемия коронавирусной инфекции (SARS-CoV-2), выдвигает на первый план решение фундаментальных вопросов биологической безопасности, связанной с изучением новых и возвращающихся инфекций, вирусов с высокой степенью изменчивости генома, обладающих повышенной эпидемической опасностью и относящихся к сфере социально значимых инфекций.
Для решения этих вопросов как никогда становится актуальной задача разработки оптимальных условий консервации и длительного хранения вирусных штаммов и создания соответствующих рекомендаций для депонирования вирусов, выделенных во время эпидемических вспышек особо опасных возбудителей или возбудителей социально значимых инфекций.
Наиболее широко используемыми методами консервации в настоящее время являются: лиофилизация; криоконсервация (ниже -80 С) и комбинация обоих методов.
Для хранения лиофилизированного вирусного материала используются низкотемпературные морозильники с температурой охлаждения до -86°C. Для хранения жидких замороженных вирусных суспензий рекомендуется использование ультранизкотемпературных морозильников с диапазоном температур до -150°C или криохранилищ с жидким азотом для хранения образцов при температуре до -196°C.
КРИОГЕННОЕ ОБОРУДОВАНИЕ
О распространенности метода криоконсервации биоматериалов свидетельствует хорошо развитая инфраструктура производства и широкий ассортимент криогенного оборудования, включающего криозамораживатели, криохранилища и транспортные криорезервуары (сосуды Дьюара различного назначения), морозильники, а также различные аксессуары и расходные материалы.
Криозамораживатели предназначены для контролируемого замораживания при помощи жидкого азота. Для криоконсервации микроорганизмов, как правило, не требуется специальных программных замораживателей, как в случае клеток эукариотов, клеточных линий и органов.
Криохранилища представляют собой специализированное оборудование, выпускаемое различными фирмами, которое обеспечивает возможность транспортировки и хранения биоматериалов в жидком азоте.
Низкотемпературные и ультранизкотемпературные морозильники. Выпускается множество типов холодильников с температурой охлаждения до -86°C и до -150°C, которые успешно применяются для хранения вирусов, бактерий и других клеточных материалов. Например, низкотемпературные морозильники от компаний PHCBI (бывш. Panasonic, Япония), Esco (Сингапур), Vestfrost (Дания), Eppendorf (Германия), Haier (КНР) и др.
МОРОЗИЛЬНЫЕ КАМЕРЫ vs КРИОХРАНИЛИЩА
К основным недостаткам стандартных криохранилищ с использованием сосудов Дьюара с жидким азотом для хранения образцов при температуре до -196°C можно отнести:
- низкую оперативность;
- потери жидкого азота в процессе хранения;
- необходимость в регулярных поставках жидкого азота и обеспечении условий для его хранения (оборудование, дополнительные помещения);
- флуктуации температуры в камере;
- высокую вероятность ошибок;
- опасность работы с большими количествами жидкого азота;
- возможность несанкционированного отбора штаммов.
В тоже время, низкотемпературные морозильные камеры обладают рядом серьезных преимуществ, таких как:
·
- Надежность и легкость в управлении;
- Минимизация ошибок оперирования;
- Наличие защитных противоаварийных систем;
- Высокая вместимость (до 70000 образцов в одном морозильнике);
- Компактность;
- Стабильная температура хранения, исключающая значительные флуктуации температуры в камере;
- Легко реализуемая возможность использования компьютерной системы управления.
Иллюстрацией сравнительных значений флуктуации температуры может служить Рис.1, на котором наглядно представлено распределение температур в различные областях обычного криохранилища с жидким азотом на разной высоте от уровня азота (слева) и в крио-камере сверхнизкотемпературного морозильника (справа).
Следует отметить, что современные крио-морозильники при необходимости могут быть оборудованы дополнительной аварийной сигнальной системой, работающей на аккумуляторе, и устройствами аварийной подачи паров жидкого азота или углекислого газа (LN2 или CO2). При наличии этих систем легко организовать обеспечение надежной работы морозильных камер и хранилищ на их основе при отключении электроэнергии или поломке оборудования с использованием:
·
- Батареи бесперебойного питания;
- Генератора переменного тока;
- Резервной системы, работающая на жидком азоте.
УЛЬТРАНИЗКОТЕМПЕРАТУРНЫЕ МОРОЗИЛЬНИКИ (до −150 °C)
Для хранения жидких замороженных вирусных суспензий рекомендуется использовать ультранизкотемпературные морозильники с диапазоном температур до -150°C. Это связано с тем, что для обеспечения длительного хранения чувствительных образцов необходимо в процессе заморозки получить аморфные кристаллы воды, содержащейся в образце, а в дальнейшем важно избежать перекристаллизации этой воды до более крупных кристаллов, приводящих к разрушению образца. Температура перекристаллизации для замороженной воды составляет в среднем от -115 до -130 ºС. При дальнейшем понижении температуры образование кристаллов льда уже не происходит, и вода замерзает аморфной стеклоподобной массой. Таким образом, хранение образцов вирусных суспензий при -150 ºС, т.е. при температуре гораздо ниже температуры их рекристаллизации, позволяет хранить такие материалы практически неограниченное время без потери свойств, что является хорошей альтернативой криохранению в жидком азоте или в парах жидкого азота, так как не требует расходных материалов.
Самые современные высокотехнологические модели морозильников для ультранизкого охлаждения предлагают компании PHCBI (бывш. Panasonic, Япония) и Haier Biomedical (КНР). Этими компаниями разработаны горизонтальные морозильники (лари), обладающие всеми техническими особенностями и решениями для надежного хранения образцов, такими как каскадная двухступенчатая система охлаждения, специально сконструированный компрессор, микропроцессорный контроль, высокотехнологичная изоляция камеры на основе V.I.P. панелей из вспененного полиуретана, различные виды сигнализации. Поддержание заданной температуры, пуск и контроль работы компрессора осуществляются автоматически, что гарантирует сохранность биоматериала, экономичность эксплуатации и увеличивает ресурс компрессора. Если компрессор перегревается настолько, что это влияет на эффективность его работы, система подаёт сигнал тревоги. Кроме того, устройство подаёт звуковой и световой сигнал при отклонении от заданной температуры в ту или иную сторону, перебоях в электропитании, отказах датчиков, падении эффективности охлаждения, чрезмерно высокой температуре окружающей среды.
Особо следует отметить уникальную систему «U–COOL», позволяющую информировать пользователя о текущих параметрах работы крио-морозильника и отказах системы с помощью SMS сообщений на мобильный телефон пользователя, с возможностью удалённого редактирования критических параметров и задания рабочей температуры. Данной функцией оснащен ультранизкотемпературный биомедицинский морозильник DW-150W200 (−126 …−150 °C) уже в базовой комплектации.
Модельный ряд ультра низкотемпературных морозильников на -150 °C
НИЗКОТЕМПЕРАТУРНЫЕ МОРОЗИЛЬНИКИ (до −86 °C)
Низкотемпературные морозильники с рабочей температурой до -86 °C представлены на рынке в широком диапазоне объемов — вплоть до 959 л, как в вертикальном, так и в горизонтальном (лари) исполнении. Для достижения столь низких температур в морозильниках используются различные конструктивные решения, такие как использование каскадной системы охлаждения, установка сверхмощных компрессоров или даже наличие двух независимых систем охлаждения с двумя независимыми компрессорами, каждый из которых может работать самостоятельно при выходе из строя второго компрессора, поддерживая заданную температуру и обеспечивая двойную защиту образцов. Например, целый ряд моделей с двойной независимой системой охлаждения TwinGuard предлагает компания PHCbi. Серия лабораторных морозильников DW-86L…S/ ST (−86°C), выполненная по запатентованной Haier Biomedical технологии TwinCool, позиционируется не только как серия морозильников с повышенной надежностью, но и отличается пониженным энергопотреблением и низким уровнем шума. В этой связи следует также отметить вертикальные низкотемпературные морозильники с технологией Salvum Smart Frequency Conversion, серии DW-86L…BP/BPT, занимающие в мире лидирующие позиции в области энергосбережения, обладая сверхнизким энергопотреблением, вплоть до 8,2 кВтч/сут. В вертикальных морозильниках, сделанных по технологии Salvum, в качестве хладагента применяется углеводородный хладагент HC, при этом компрессоры оборудованы инверторными двигателями с регулируемой частотой вращения, что позволяет экономить электроэнергию и продлевает срок службы компрессора. Модели этой серии характеризуются низким уровнем шума за счёт технологии адаптивного контроля, которая управляет вентиляторами и компрессорами, обеспечивая снижения уровня шума до 43,5 дБ. Для снятия данных предусмотрен USB порт. Модели с индексом «T» имеют панель управления с тачскрином, позволяющей осуществлять отображение параметров в реальном времени через ЖК дисплей. Эта панель управления может быть синхронизирована со смартфоном или персональным компьютером (опция). Модели с новой панелью управления могут быть подключены к информационной системе управления лабораторией Haier BIMS, включающей в себя систему инвентаризации образцов.
Для повышения безопасности сохранения образцов и минимизации поступления теплого воздуха из окружающей среды низкотемпературные морозильники оснащаются, помимо внешней двери, дополнительными внутренними дверьми, что гарантирует минимизацию колебаний температуры при открытии.
При необходимости, возможно оснащение криогенных низкотемпературных морозильников дополнительными устройствами, такими как системы аварийной подачи паров жидкого азота или углекислого газа (LN2или CO2), способные поддерживать рабочую температуру в течение не менее 24 часов; логгерами данных на автономном питании для измерения и записи рабочих параметров; дистанционными системами аварийной сигнализации.
Модельный ряд биомедицинских морозильников на -86°C
СИСТЕМЫ РЕЗЕРВНОГО ПОДДЕРЖАНИЯ ТЕМПЕРАТУРЫ
Как уже отмечалось, современные крио-морозильники могут быть оборудованы дополнительной системой резервного поддержания температуры (так называемая back-up система), которая необходима в первую очередь для обеспечения сохранности биоматериалов при отключении электропитания. В случае повышения температуры в камере морозильника относительно заданной, автоматически включается back-up система и в камере крио-морозильника открывается клапан, через который впрыскивается азот или углекислый газ, что позволяет обеспечивать работоспособность морозильника в случае отключения электроэнергии за счет наличия в back-up системе независимого энергоснабжения.
Аварийная back-up система охлаждения с использованием LN2 (для поддержания температуры от -90°С до -135°С)
Резервная система охлаждения LN2 — это независимая холодильная система для ульранизкотемпературных морозильников. При аварийной потере мощности и увеличении температуры в камере, срабатывает сигнализация, после чего резервная система LN2 автоматически активируется, подавая LN2 в камеру для поддержания требуемой температуры. Резервная система работает от перезаряжаемой батареи. При этом температура в камере поддерживается на уровне примерно -135 °С в течение до 24 часов при объеме азота в сосуде Дьюара в 100 л.
Основные преимущества:
- Блокирование впрыска LN2 при открытии двери
- Схема защиты для предотвращения перезаряда батареи
- Легкий вес и портативная конструкция, позволяющая установить систему сверху морозильной камеры Функции сигнализации при низком заряде батареи и показании ошибок датчиков
Аварийная backup система охлаждения с использованием CO2 (для поддержания температуры от -40°С до -70°С)
Аварийная back-up система охлаждения с использованием CO2 применяются для страхования безопасности образцов, подлежащих хранению в низкотемпературных морозильниках.
- Система компактна и удобна в использовании
- Настройки интерфейса позволяют регулировать температуру
- Простое программирование
- Система может быть установлена на любой низкотемпературный морозильник, имеющий специальное отверстие для присоединения
Преимущества
- На панели управления имеется контрольная кнопка для проверки работоспособности системы
- Сигнализация низкого уровня СО2 в баллоне - предупреждает пользователя о том, что надо заменить баллон с жидким СО2
- Позволяет поддерживать необходимую температуру до 48 часов
АКСЕССУАРЫ И ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЕ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ ДЛЯ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНЫХ МОРОЗИЛЬНИКОВ
Низкотемпературный морозильник рекомендуется использовать со специальными системами хранения, что обеспечит оптимальное использование пространства. Целесообразно также пользоваться специальным пластиком (пробирки, штативы), выдерживающим низкие температуры. Для большинства клеток оптимальная скорость криоконсервации составляет 1°C/мин при температуре до -80 °С, для чего были разработаны специальные штативы для криозаморозки, которые, находясь в морозильной камере, позволяют избежать резкого снижения температуры и обеспечивают медленное и равномерное замораживание клеток в криопробирках и виалах, без необходимости использования программных криозамораживателей.
Криопробирки (1)
Криопробирки применяются для хранения биологических образцов, как одноразовые лабораторные расходные материалы. Криопробирки могут эксплуатироваться при температуре в диапазоне -196°С... +121 °С. Криопробирки изготовлены из медицинского полипропилена, имеют круглое дно и прозрачные стенки. Они стерилизованы гамма-излучением и упакованы в стерилизованные пакеты. Силиконовое кольцо, вкладываемое в винтовую крышку, предотвращает загрязнение, вызванное утечкой жидкости, обеспечивая безопасность образцов.
Криобоксы (2)
Для удобства хранения криопробирок используются криобоксы, представляющие собой коробки с гнездами для установки в них криопробирок. Криобоксы разработаны по стандартным размерам и соответствуют стандартным криопробиркам и стеллажам для крио боксов. Криобоксы хорошо вентилируемы и обеспечивают быстрое охлаждение.
Криобоксы изготовлены из полипропилена и пригодны для использования при температурах от -80°С до +121°С. Криобоксы химически устойчивы к спиртам и мягким органическим растворителям.
Стеллажи с выдвижными полками для криобоксов (3)
Стеллаж для криобоксов (3)
Стеллаж для криобоксов, выполненный из нержавеющей стали, представляет собой конструкцию с выдвижными полками, устанавливаемую на полку низкотемпературного морозильника. Стеллажи имеют стандартные размеры и подходят для большинства типов криобоксов.
Дополнительные принадлежности для низкотемпературных морозильников HAIER DW-86
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Из представленного материала видно, что криоконсервация микроорганизмов в низкотемпературных камерах, несомненно, является весьма удобным и эффективным способом хранения различных штаммов вирусов и бактерий. При этом необходимо отметить, что данный способ криоконсервации получает всё большее распространения в качестве альтернативы классической схеме консервации с использованием жидкого азота. В табл.1 представлены рекомендованные режимы криохранения для широкого ряда биологических объектов.
Таблица 1. Рекомендованные требования к хранению биоматериалов
|
Штаммы бактерий |
-70°С |
|
Хранение спермы (ветеринария, ЭКО) |
-80°С (-196°С) |
|
Хранение стволовых клеток |
-80°С (-196°С) |
|
Криоконсервация клеток крови (эритроцитов и тромбоцитов) |
-30°С (-80°С) (либо при -150°С/-196°С) |
|
Штаммы вирусов (зараженные культуры клеток) |
-80°С (-196°С) |
|
Биопробы |
-80°С (-196°С) |
|
Костные трансплантаты |
-60°С |
В ряде музеев многие бактериальные культуры достаточно успешно хранятся при температурах, которые обеспечивают современные морозильники (обычно до минус 86 °С). При этих температурах хранения скорость отмирания может быть в 1000 раз меньше, чем при минус 10°С
Опубликовано: "Фармацевтические технологии и упаковка" №4.2, 2021
